[發明專利]一種十一肽及其制備方法和用途

無效

• 申請號: 00105799.5
• 申請日: 2000-04-11
• 公開（公告）號: CN1317493A
• 公開（公告）日: 2001-10-17
• 發明（設計）人: 盛樹力;姬志娟;趙詠梅;王蓉;趙志煒;張景艷;艾厚喜
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學宣武醫院
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;A61K38/08;A61P25/00;A61P25/16
• 代理公司: 北京市蕾波醫藥衛生專利代理事務所
• 代理人: 于淑惠

本發明涉及肽化學，特別是涉及一種新的11肽，其制備方法和用途。

APP11肽是我們首次發現的一種新的多肽，迄今尚未發現有關它肽的任何報道。

90年代中期曾經發現APP17肽，β-淀粉樣肽前體蛋白(β-Amyloid?precursor?protein,APP)肽鏈中第319-335位的肽段具有神經營養作用，包括：促進軸突生長、增加突觸密度、能保護缺血引起的腦神經元損傷。

本發明的目的是要尋找一種肽鏈較APP17肽短，合成較APP17肽容易的，具有神經營養作用的多肽。經過幾年的研究我們最終發現了一種新的11肽，APP11肽，它不但具有神經營養作用，而且可能治療神經元退行性變。

本發明的APP11肽是β-淀粉樣肽前體蛋白N端第63-73位肽段，由11個氨基酸殘基組成，序列為異亮氨酸-天冬氨酸-蘇氨酸-賴氨酸-谷氨酸-甘氨酸-異亮氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸-半胱氨酸(IDTKEGILQYC)。我們經反復研究APP?N端各種不同長度的多肽片段的生物活性，最終發現并確定APP11肽具有神經營養作用。

迄今為止我們的研究發現APP11肽具有如下功能：

1．在體外，能增加人神經母細胞瘤株SY5Y細胞胞體面積和軸突長度，促進細胞增殖和存活能力。

2．改善糖尿病小鼠的學習記憶功能和海馬神經元中一些重要蛋白質的表達。

3．改善糖尿病小鼠坐骨神經傳導速度和一些蛋白質的表達。

以上結果表明APP11肽具有神經營養作用，并存在改善實驗性神經元退行性變的能力。

本發明APP11肽采用固相法合成，固相肽合成的主要思想是：先將所要合成肽鏈的羧基末端氨基酸的羧基以共價鍵的結構同一個不溶性的高分子化合物(樹脂)相連接，然后以此結合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份，經過脫去氨基保護基并同過量的活化羧基組份反應，接長肽鏈。這樣的步驟可以反復地多次進行下去，最后達到所需要合成的肽鏈的長度。下式表示了這個合成過程。原料：

HMP?resin(P-羥甲基苯氧甲基多聚乙烯樹脂)

Fmoc-AA(9-芴基甲氧羰酰基保護的氨基酸)

NMP氮甲基吡咯烷酮

DCM二氯甲烷

???甲醇????

哌啶

DMAP二甲基氨基吡啶

HOBT羥基苯并三唑

DCC二環己基碳二亞胺

TFA三氟乙酸

EDT?1,2-乙二硫醇

硫代苯甲醚

結晶苯酚

乙腈

儀器：

多肽自動合成儀(美國ABI431A型)

旋轉蒸發儀(日本Yamato?RE50)

高效液相色譜儀(美國PE151A型)

冷凍干燥機合成方法：

稱取HMP樹脂100mg，取代當量是1.0meq，即0.1mmol于美國ABI431A型多肽自動合成儀的反應腔內，由合成儀自動將特定的AA按不同的順序連接起來，偶聯率達99％。反應如下：1．氨基酸的活化(HOBt/DCC法)

Fmoc保護的氨基酸

2．聯接氨基酸到樹脂上

3．脫去氨基酸的Fmoc保護基

4．氨基酸的活化(HOBt/DCC法)

???HOBt/DCC

5．偶聯

????????????新的偶聯的肽-樹脂

重復3-5直至合成結束，得到APP11肽的肽樹脂。

IDTKEGILQYC-樹脂350mg將肽鏈從樹脂上切落：用TFA(三氟乙酸)切割肽鏈，用EDT，硫代苯甲醚，H2O作清除劑，在室溫下反應3.0小時，除去切割試劑，再用乙醚萃取，得到APP11肽的粗品為100mg，收率為85％。APP11肽的純化

高效液相色譜分離純化：

條件：色譜柱????C₈10×100mm

??????色譜儀????ABI?151A型??????????美國

??????流動相????A-0.1％TFA(三氟乙酸)H₂O

????????????????B-0.1％TFA(三氟乙酸)于60％乙腈

??????檢測波長??214nm

??????流速??????4ml/分鐘

??????洗脫梯度??20-60％B于30分鐘HPLC(高效液相色譜)分析

??????色譜柱：??C₁₈4.6×150mm